Siirry sisältöön

Aikuinen mameshiba ja normishiba. Kuva (c) Pervin, S.; Islam, M.S.; Yorisada, Y.; Sakai, A.; Masamune, S.; Yabuki, A.; Rakib, T.M.; Maki, S.; Tacharina, M.R.; Yamato, O. Carrier Rate and Mutant Allele Frequency of GM1 Gangliosidosis in Miniature Shiba Inus (Mame Shiba): Population Screening of Breeding Dogs in Japan. Animals 2022, 12, 1242. https://doi.org/10.3390/ani12101242

Toukokuun PubMed-julkaisuista löytyi uusi mameshiboja käsittelevä tutkimus. Mameshiba on shiban kääpiömuunnos, jota perinteikäs Japanilaisen koiran suojeluyhdistys NIPPO ei tunnusta. Tutkimuksessa on kartoitettu shibojen GM1-gangliosidoosin geenivirheen esiintymistä mameshiboissa. Tulos: mameshibat ovat perineet geenivirheen geenipooliinsa, sillä 1832 tutkitusta koirasta löytyi yhdeksän kantajaa.

Tutkimustulos ei yllätä eikä edes ollut se syy, mikä kiinnitti huomion (paperista käy lisäksi ilmi, että Kiinassa ja Koreassa on tavattu GM1-sairaita normishiboja, mikä viittaa siihen, että geenivirhe on päässyt vähitellen leviämään) - vaan se, että tällainen mameshibatutkimus on ylipäänsä olemassa.

Nuo 1832 tutkittua koiraa olivat kaikki jalostuskoiria yhteensä 143 eri mameshibakennelistä Japanissa.

Eikä tämäkään ollut vielä se, mikä kiinnitti huomion, vaan tutkimusjulkaisun alustuksessa esiintynyt toteamus, että tällä hetkellä mameshiboista on tulossa [Japanissa] suositumpia kuin normishiboista. Virallisia rekisteröintilukuja ei ole saatavilla, joten lähde jää avoimeksi, mutta 143 mameshibakenneliä yhessä ainoassa tutkimuksessa on kieltämättä enemmän kuin ite odotin. Miten monta niitä kaikkiaan jo on?

Jossain vaiheessa mameshiboille on perustettu oma yhdistyksensä Nihon Mame Shibaken Association eli NMSA, jonka kotisivut avattiin vuodenvaiheessa. NMSA on samalla toinen mameshibojen rekisteri. Aikaisemmin vain Kennel Club of Japan (KCJ, joka on eri asia kuin JKC) on rekannut mameshiboja.

Mameshibojen olemassaolon virallinen syy on ilmeisesti niiden käyttötarkoitus: Japanin ikääntyvä ja yksinäinen väestö kaupungeissa tarvitsee pienen ja kiltin seurakoiran. Kannattaa oikeasti katsella mameshiban rotu(?)määritelmä läpi kääntäjän kautta, koska siinä näyttää olevan muutamia ulkomuotojuttuja, jotka heijastavat tuota käyttötarkoitusta. Ilme ei saa olla shibamaisen tuima ja arvokas?

Ei ole missään nimessä uusi asia, että rodusta splittaa erilleen toinen rotu, mutta tuntuuko jokin mameshiban luomisessa epäkunnioittavalta alkuperäistä NIPPO:a kohtaan? Alkuaikoina ei tunnettu molekyyligenetiikkaa, joten koiria mittailtiin senkin edestä. Hautalöytöjen luita mittailtiin. Ensimmäisiä näyttelyosallistujia mittailtiin. Jopa itse Hachikoa mittailtiin, ja mittausten perusteella jaettiin japanilaiskoirat pieniin, suuriin ja keskikokoisiin. Ja laadittiin rotumääritelmä, jossa pienen japanilaiskoiran eli shiban säkäkorkeudeksi määriteltiin 35-42.5 cm. Mameshiban hyväksytty säkäkorkeus voi olla kaksikymmentäviisi senttiä. 😀 Whatever shibat pelastaneen NIPPO:n tekemä mittailutyö. Ja rohkeaa arvokkuutta ei käsittääkseni tule liikaa ilmentää, koska se olisi ristiriidassa ystävällisen seurakoiran kanssa, vaikka shiban arvokas yleisolemus on se, mitä NIPPO-näyttelyissä on aina haettu.

Uskon, että mameshiboista löytyy myös sinänsä puhdasrotuisia koiria, joita ei ole pienennetty roturisteyksillä. Normishiboissa näyttää olevan geneettistä potentiaalia koon muunteluun (kts. juttu kokomarkkereista), eikä ole tavatonta, että pienikokoisille normishiboille myös syntyy pienikokoisia pentuja. Oletan, että tällaisia pieni x pieni -pentueita jatkamalla päästäisiin lopulta mameshiban kokorangeen ja ominaisuus muuttuisi varsin periytymisvarmaksi.

Kysymys tietty kuuluu, että milloin mameshibat lähtevät normishibojen perässä maailmalle. Tarvitaanko siihen välttämättä rotustatusta? Suomessa niitä ei voisi tällä hetkellä rekata mihinkään, joten ken tietää, ehkä ekat "eksoottiset" mameshibat ovatkin jo täällä.

Päivitys: tilastotietoa NIPPO-rekisteröityjen normishibojen lukumäärästä vuosittain. Rekkaukset on 2000-luvulla liikkuneet 30 000 koiran molemmin puolin. Tällä hetkellä suuntaus on hiukan alaviistoon. Ehkä osa kaupallisista lemmikkikasvattajista on todella vaihtanut mameshibaan, mutta syitä voi olla monia muitakin. Seuraavien parin kolmen vuoden rekisteröintiluvut ovat joka tapauksessa kiinnostavia.

Syksyllä 2021 eläinlääketieteen lehdessä julkaistiin tapauskertomus japanilaisesta shikoku-uroksesta, jonka sairaus diagnosoitiin oirekuvan ja solulöydösten perusteella NCL-taudiksi eli neuronaaliseksi seroidilipofuskinoosiksi. NCL-taudit ovat geenivirheen ja viallisen proteiinin aiheuttamia kertymäsairauksia, jotka johtavat aivojen surkastumiseen. Periytymismalli on resessiivinen, eli sairaan koiran molemmat vanhemmat ovat oireettomia taudinkantajia*.

NCL-taudit tunnetaan myös ihmisillä. Kirjainyhdistelmän edessä on usein jokin neljäs kirjain, joka kuvaa taudin puhkeamisikää. ANCL (adult), JNCL (juvenile)... sekä suomalaisittain pelätty INCL (infantile). NCL-tautien puhkeamisikään ja etenemisnopeuteen vaikuttaa se, missä geenissä geenivirhe sijaitsee ja miten pahasti se häiritsee proteiinin toimintaa. Omistaja oli huomannut tapauskertomuksen shikokunkoiran ensimmäisen oireen, kävelytyylin muuttumisen, vasta koiran ollessa yli 2,5-vuotias, joten sen tauti luokiteltiin aikuisiällä puhkeavaksi.

Sairaus nimihirviön takana, taas kerran

Aivonsurkastumataudeilla on jostain syystä mitä erikoisimpia nimiä, kuten shibojen GM1-gangliosidoosi. Neuronaalinen seroidilipofuskinoosi kuvaa sitä, että etenkin hermosoluihin ilmestyy "sairaalloista" kertymäainesta (seroidi), joka näyttää samalta kuin ikääntymiseen liittyvä normaali kertymäaines (lipofuskiini). Kertymäaineen tarkempi sisältö vaihtelee eri NCL-taudeissa.

Aivojen hermosolut ovat vialliselle proteiinille erityisen herkkiä ja alkavat kuolla. Koska hermosolut eivät juuri jakaannu, ne eivät voi jakaantumalla vähentää yhden solun sisältämää kertymäainesta. Tai sitten puuttuvaa proteiinia tarvitaan hermosolun ylläpitoon jollakin muulla tavalla. NCL-tautimekanismi ei ole vielä selvillä, mutta taudin merkittävimmät oireet johtuvat joka tapauksessa hermosolujen etenevästä tuhoutumisesta.

Vielä lisää nimeämisen outoudesta: tiedejulkaisuissa NCL-taudit on yleensä numeroitu ja käännetty kirjaimet nurin, CLN1, CLN2, CLN3 jne. Tämä vastaa myös geenien nimeämistä. Joskus näistä käytetään myös termiä lysosomaaliset kertymäsairaudet, sillä useat NCL-taudit johtuvat vioista proteiineissa, jotka toimivat solun kierrätyskeskuksissa eli lysosomeissa.

Etenevät neurologiset oireet

Tapauskertomuksen shikokunkoiralla alkoi ilmetä oudon kävelytavan lisäksi mm. raajojen tärinää ja pään kääntelyä puolelta toiselle. Koira sokeutui vähitellen, sen liikkuminen vaikeutui entisestään ja tauti alkoi näkyä myös käytöksessä sekä ääntelyssä. Eutanasia tehtiin 5 v 8 kk iässä omistajan pyynnöstä.

Koiran aivot tutkittiin magneettikuvauksella kolmesti: 2 v 11 kk, 4 v 7 kk ja 5 v 8 kk iässä. Kuvista, ja eutanasian jälkeen ruumiinavauksessa, havaittiin aivojen etenevä surkastuminen. Hermosoluissa näkyi NCL-taudeille ominaista kertymäainesta. Hermosolujen tuhoutuminen ja kertymäaineksen määrä oli kuitenkin vähäisempää kuin muiden koirarotujen vastaavissa tapauksissa.

Pään kallistelu oireena koirien lysosomaalisissa kertymäsairauksissa. Kuvassa C on tapauskertomuksen shikokunkoira 3 v 10 kk iässä. Kuvassa E on puolen vuoden ikäinen GM1-gangliosidoosia sairastava shiba. Kuva (c) Tamura S, Tamura Y, Nakamoto Y, Hasegawa D, Tsuboi M, Uchida K, Yabuki A and Yamato O (2021) Positioning Head Tilt in Canine Lysosomal Storage Disease: A Retrospective Observational Descriptive Study. Front. Vet. Sci. 8:802668. doi: 10.3389/fvets.2021.802668.

Geenivirhe vielä etsinnän alla

Koira testattiin muiden rotujen aikuisiän NCL-taudin geenivirheen varalta. Kyse ei ollut samasta geenivirheestä. Tämä tarkoittaa sitä, etteivät nykyiset geenitestit tunnista tätä shikokunkoirien NCL-tautia tai sen kantajia. Tapauskertomuksen lopussa mainitaan, että tutkimusryhmän seuraavana tavoitteena on shikokunkoiran NCL-taudin aiheuttavan geenivirheen selvittäminen. Tämä olisi hyvä, sillä shikokunkoirien vuosittaiset rekisteröintimäärät on nykyään niin pieniä, etteivät ne olisi tarvinneet jäljellä olevaan kantaansa tällaista perinnöllistä sairautta. Hyvänä puolena yksittäisen geenivirheen aiheuttamassa taudissa on se, että geenitestin avulla kantajat osataan yhdistää geenivirheestä vapaaseen koiraan, jolloin kaikki pennut saavat toimivan geenin (ja yksikin sellainen riittää) ainakin toiselta vanhemmaltaan*.

Yksi vai useampi geenivirhe?

Shikokun omistajat netissä ovat selvästi olleet tietoisia rodussa esiintyvästä neurologisesta sairaudesta jo vuosia sitten. Oirekuvaukset muistuttavat NCL:ää, mutta erikoista on oireiden alkamisikä, puoli vuotta, joka poikkeaa tässä tapauskertomuksessa kuvatun shikokun oireiden alkamisiästä (2,5 + vuotta). Toki NCL-taudeissa on jonkin verran yksilökohtaista vaihtelua, mutta kahden vuoden ero kuulostaa aika suurelta. Tyypillisesti NCL-taudin myöhäisempi puhkeaminen ja hitaampi eteneminen johtuu siitä, että geenivirhe on eri geenissä, tai geenivirhe on sen verran "lievä", että proteiini pystyy vielä toimimaan edes puoliteholla. Ei ole tavatonta, että NCL-tautia sairastava henkilö on perimältään yhdistelmäheterotsygootti, eli kumpikin vastingeeni on viallinen, mutta niissä on eri mutaatio. Eri geenivirheet on voineet periytyä vanhemmilta, tai toinen geenivirhe on voinut syntyä ns. de novo -mutaationa vain siinä siittiössä tai munasolussa, josta sairas yksilö on saanut alkunsa. (*-tähtimerkityt kohdat aiemmit eivät huomioi tätä harvinaista tilannetta, jossa kantajan yhdistäminen geenitestin perusteella puhtaaseen johtaa silti sairauteen.) Jos kyse on oikeasti ollut useammasta mutaatiosta, niin näistä vaihtoehdoista shikokujen kannalta on parempi de novo -malli, jolloin kannassa olisi liikkeellä vain tuo yksi valtamutaatio.

Lähteitä ja luettavaa

Adult-Onset Neuronal Ceroid Lipofuscinosis in a Shikoku Inu (Tamura ym., 2021)

Positioning Head Tilt in Canine Lysosomal Storage Disease: A Retrospective Observational Descriptive Study (Tamura ym., 2021)

http://www.nihonken.co/2018/09/lysosomal-storage-disease-in-shikoku.html

https://incltutkimus.info/

"Shiba on geneettisesti kaikkein lähinnä sutta oleva koirarotu."

Tämä toteamus tulee jossakin muodossaan aika nopeasti vastaan, kun alkaa etsiä tietoa rodusta. Kuvatodisteena on luultavasti allaolevan näköinen käppyrä, mahdollisesti pystysuuntaan käännettynä ja vielä shiban kuvalla muokattuna. Alkuperäinen grafiikka on peräisin Science-lehden lähes 20 vuotta vanhasta tiedejulkaisusta Genetic Structure of the Purebred Domestic Dog (Parker ym., 2004).

Alkuperäisessä tutkimuksessa ei väitetä, että tulosten perusteella shiba olisi geneettisesti lähinnä sutta oleva koirarotu, että shiballa olisi lähes suden geenit, tai että vain shiballa olisi susimaiset geenit.

Tutkimusjulkaisu sinänsä on laadukas ja ollut aikanaan uraauurtava. Sen popularisoinnit on vaan vedetty välillä överiksi, mistä legendat ovat arvatenkin syntyneet. Katsotaan, mitä tutkimuksessa on tehty ja mitä ei ja mitä kuvaaja todella esittää. HUOM! Tulkintavirheiden mahdollisuus on ilman muuta olemassa. Älä usko sokeasti tätäkään blogitekstiä.

1. Tutkimuksessa ei ole suoraan vertailtu geenejä.

Sana "geneettinen" hämää ymmärrettävästi ajattelemaan geenejä, vaikka parempi mielleyhtymä olisi tällaisissa genomi eli otuksen koko perimä. Perimässä on muutakin DNA:ta kuin aktiivisia geenejä. Kokonaisten geenien ja niiden vaikutuksen tutkiminen olisi nykytekniikallakin vielä aivan liian työlästä. Siispä on tutkittu snippejä (jotka on yhden ainoan DNA:n kirjaimen muutoksia eri puolilla genomia) ja kaksikirjaimisia toistojaksoja (joissa DNA:n kirjaimet toistuvat eri pituisina versioina, esim. yhdellä koiralla voi olla ATATATATATAT ja toisella ATATAT). Molempia pidetään pitkälti neutraaleina geneettisinä markkereina, jolloin ne ovat vapaita mutatoitumaan ilman, että mitään tapahtuu.

Sattuma on vaikuttanut siihen, minkälainen markkerivalikoima rodun perustajakoirilla on ollut, kun rotu on muodostettu. Nämä rotukohtaiset markkerit on sittemmin voineet pysyä ennallaan tai mutatoitua eteenpäin rodun sisällä. Tutkimuksessa eri rotujen edustajat pystyttiin lähes täydellisen luotettavasti luokittelemaan omaan rotuunsa rodun geenimarkkerien perusteella.

Joskus snipit voivat osua geenin kohdalle siten, että geenituotteen toiminta todella muuttuu. Kaksikirjaimiset toistojaksot eivät yleensä sijaitse geenien koodittavalla alueella. Tietyt snipit ja toistojaksot voivat kuitenkin sijaita geenien vieressä ja periytyä yhdessä tietyn geenimuodon kanssa. Jos valinta alkaa suosia tietynlaista geenimuotoa, yleistyy myös sen vieressä sijaitseva (taikka siipeilevä) markkeri, vaikka tuo edellä mainittu ATATAT.

2. Tutkimuksessa on ollut mukana vain viisi shibaa.

Rotujen edustajien lukumäärä on ollut pakko rajata johonkin, koska jo eri rotuja oli mukana 85. Otoskokoa on aina hyvä pitää silmällä. Tilastollisen merkitsevyyden testit pyrkivät selvittämään, onko tuloksen saanut aikaan pienen otoskoon aiheuttama sattuma vai onko havaittu ilmiö luultavasti todellinen.

3. Evoluutiopuussa shiba ei ollut lähimpänä sutta.

Tutkimuksessa toistojaksojen eri pituusversioiden yleisyyttä eri roduissa (alleelifrekvenssit) käytettiin evoluutiopuun luomiseen. Tietokoneohjelma on analysoinut sille syötettyä tietoa eri rotujen alleelifrekvensseistä ja mallintanut erilaisia tapoja, miten mutaatiot ovat voineet historiassa tapahtua. Evoluutiopuun oksanhaaran voi tulkita siten, että sen kohdalla on ollut ylä- ja alaoksan viimeisin yhteinen esivanhempi, minkä jälkeen oksat eivät ole enää lisääntyneet (versoneet?) keskenään.

Oksien pituudella on merkitystä, joten Shar-Pein oksa näyttää olevan lähimpänä sutta. Myös oksanhaarojen numeroarvoilla on merkitystä. Ne kuvaavat sitä prosenttilukemaa, jolla tietokone sai saman haarautuman syntymään, kun se analysoi samat tiedot 500 kertaa. Shar pein ja shiban, chowin ja akitan erottava haarautuma esimerkiksi ilmestyi 280 kertaa, ja 220 kertaa ilmestyikin jotain muuta. Ehkä kiinnostavampi on tuo ensimmäinen 100% toistuva oksanhaara, jossa neljä itämaista rotua on joka kerta erkaantunut kaikista muista tutkituista roduista? Kaavioon on merkitty numerolla ne oksanhaarat, jotka toteutuivat ainakin puolessa 500 toistosta. Shiban oksalla ei ole numeroarvoa.

4. Tutkimuksen sudet olivat nykyisiä susia.

Nykykäsitys on kallellaan siihen suuntaan, että sekä nykyiset sudet että kesykoirat polveutuisivat samasta kantamuodosta, jota ei ole enää olemassa. Herää kysymys, missä yhteyksissä nykysusien DNA:n neutraaleja geneettisiä markkereita voi silloin verrata nykykoirien markkereihin, kun tutkitaan koirarotujen kehityshistoriaa, jos molemmat ovat mutatoituneet omia teitään jo vuosituhansien ajan. Toisaalta joissakin roduissa saattaa olla hyvinkin tuoretta geenimateriaalia sudelta, jos nykysusi ja koira ovat risteytyneet keskenään.

5. "Shibakäppyrän" idea ja rotujen omituinen järjestys.

No niin. Se tunnettu kuvaaja. Kyseessä on ryhmittelyanalyysikuva, jota varten kaikkien koirien (ja kahdeksan suden) kaikki geneettiset markkerit on annettu tietokoneen rouskutettavaksi. Tietokone on pyrkinyt jakamaan ne jonkinlaisella mutaatiologiikalla eri ryhmiin. Kirjain K kuvaa sitä, montaako eri ryhmää tietokoneen on käsketty etsiä. Esimerkiksi K=2 on jakanut kaikki markkerit kahteen ryhmään. Ryhmään 1 luokiteltuja markkereita on löytynyt eniten niiltä roduilta, jotka äskeisessä evoluutiopuussa näyttivät alkukantaisimmilta. Ryhmään 2 kuuluivat kaikki muut markkerit. Kun K-lukua on nostettu eli tietokone on etsinyt useampia ryhmiä, on 2. ryhmä jakautunut vielä useampiin pienempiin ryhmiin, joita kuvaavat eri värit. Näissäkin analyyseissa on ollut monta toistoa.

Rotujen sarakkeet muodostuvat viiden (?) koiran pystypalkeista, tosin kuvassa pikselit eivät silloin mene tasan. Jokaiselle koiralle on merkitty väreillä ne osuudet, jotka sen snipeistä ja toistojaksoista kuuluvat tietokoneen määrittämään ryhmään 1 (keltaiset) ja ryhmään 2 (punaiset).

Sille, miksi Shiba Inu on sijoitettu harmaasuden viereen ekaksi koiraroduksi, ei tutkimuksesta löydy selitystä. Jos keltaisuuden osuutta katsotaan, niin chowin ja akitan pitäisi olla sen edellä. Entä miksi lähes keltainen basenji on sijoitettu paljon punaisemman malamuutin jälkeen? Uskaltaako sanoa, ettei näiden rotujen järjestyksellä ole oikeasti kovin suurta merkitystä. Erot top-rotujen välillä ovat mitättömän pieniä ja koiria tosi pieni määrä. Pohdintatehtävä: miltä kuvio näyttäisi, jos shiboiksi olisi sattumalta osunut viisi shiban nr. 3 kaltaista yksilöä?

K=4 -graafinen taulukko numeerisena. Rotujen järjestykselle on tässäkin muodossa hankala keksiä logiikkaa.
Jos tämä popularisoitu grafiikka todella pohjautuu tähän samaan tutkimukseen, mihin kyllä viittaa rotujen tuttu järjestys, niin "wolflike"-ominaisuuden määrittelyssä eri roduille ei ole järkeä. Tai jos saat siihen järkeä, niin kommenttiboksi on sitä varten.

Johtopäätökset

"Shiba on geneettisesti lähimpänä sutta." muuttui muotoon "Viiden tutkitun shiban geneettisistä markkereista (jotka ei ole geenejä) suurin osa luokiteltiin samaan geneettisten markkerien 1. ryhmään kuin useimmat nykysuden vastaavat geneettiset markkerit. Tosin chowien ja akitojen pitäisi olla kuvassa shibojen edellä, jos rodut olisivat järjestyksessä."

Mitä tutkimustulos merkitsee? On huomionarvoista, että tietokoneanalyysit listasivat geneettisten markkereiden perusteella alkukantaisimmiksi niitä rotuja, joita on jo valmiiksi pidetty historian valossa alkukantaisina. Tutkimuksessa arveltiin, että 1. ryhmän geenimarkkereihin painottuvat alkukantaiset rodut voivat parhaiten edustaa sitä geenipoolia, mikä vanhoissa kesykoirissa on ollut olemassa. (Akitan lähihistoriaan jo jonkin verran tutustuneena on ehkä vähän yllättävää, että nykyakita näytti tutkimuksessa noin alkukantaiselta?)

Geneettisten markkerien yhteys erilaisiin geenimuotoihin, jotka saavat aikaan erot käytöksessä ja muissa sudet ja koirat erottavissa ominaisuuksissa, on se kiinnostava kysymys. Lienee selvää, ettei yhelläkään kesykoiralla voi olla jäljellä suden geenimuotoja, jotka koodittavat (keksitty esimerkki) "ultraherkkää reseptoria", joka aiheuttaa villieläimelle luonnossa hyödyllisen ihmisarkuuden tai reaktiviisuuden.

Toisaalta solun perusmetaboliaan liittyvillä geeneillä ei varmaankaan ole ollut syytä tai aikaa mutatoitua sitten suden ja kesykoiran yhteisen kantamuodon. Siinä mielessä jokainen koira on pitkälti geneettinen susi, myös noissa roduissa, jotka eivät kuuluneet "keltaisiin".

Koiran (beagle) ja suden geenin koodittava osa linjattuna allekkain. Tällä ohjeella valmistuu konneksiini 40 -proteiinia.

Mutta onko shiboilta löytynyt upouusissa geenitutkimuksissa muutamia geeniehdokkaita, jotka oikeasti saattavat olla perua aivan tietynlaiselta sudelta ja erottaa japanilaisrodut länsimaalaisista roduista? Siitä lisää jatko-osassa nimeltä Shiba ja japaninsusigeenit (2/2). : D

Emmalle kiitokset keskusteluista ja hyvistä huomioista liittyen Parker et al. -paperiin. Kaikki mahdolliset tulkintavirheet tekstissä ovat edelleen vain omiani.

Näkökulman vaihtaminen on usein hyödyllistä ja hauskaakin. Mitä jos shiba näyttäytyisi hetken ajan DNA:han pohjautuvana eliönä? Maapallolla tunnettu elämä perustuu nukleiinihappoihin, joihin säilötään tietoa ja joilla on ainutlaatuinen kyky monistaa itseään. Eliöt voi ajatella DNA:n ympärilleen rakentamina kuorina. Elämän historia on jäljitetty (älä kysy miten) alkamaan noin neljä miljardia vuotta sitten. Koska ihmismieli ei pysty hahmottamaan miljardien suuruusluokan merkitystä, käytetään ajankulun havainnollistamiseen monesti kellovertausta, jossa planeetan koko historia on tiivistetty 12 tuntiin.

Elämä ilmestyy planeetalle noin kello kaksi. Eliöt ovat pitkään hyvin yksinkertaisia, ja ekat monisoluiset ilmaantuvat vasta kello kahdeksan maissa. Nisäkkäitä on ollut olemassa viimeisen tunnin ajan ennen puoltapäivää. Kuvassa juuri ja juuri erottuva "First Hominins"-täppä ennen nykyhetkeä kuvaa ihmisapinoiden olemassaoloa. Ajallisesti se vastaa kahta miljoonaa vuotta. Nykyihmisiä on ollut olemassa silmänräpäyksen ajan, ja ihmisen shibaksi määrittämiä rotukoiria mitättömän hetken olematon murto-osa. Silti elämän periaate niissä on ikivanhaa.

Vuoristoalueiden pieniä japanilaiskoiria 1900-luvun alussa.

Kainkoira Yamanashista. Kuva (c) Vanha japanilaisen koiran valokuva-albumi

Blogissa on aiemmin käyty läpi shiban värigenetiikan kannalta olennaiset lokukset E (värillinen vai valkoinen), A (perusväri) ja S (pinto ja sukat). Muut tunnetut värilokukset eivät tiettävästi vaikuta shibojen keskinäiseen värivaihteluun, koska kaikilla shiboilla on näistä sama versio. Esimerkiksi tämän postauksen aiheena olevassa K-lokuksessa nykyshiboilla on vain tylsää tavisversiota ky, joka sallii A-lokuksen määrätä värin. Joillakin japanilaisroduilla, kuten akitalla ja kainkoiralla, K-lokuksessa esiintyy myös raidallisen brindlekuvioinnin aiheuttavaa versiota. Tai ehkä on viisainta sanoa, että ainakin nykytiedon valossa brindleväritys yhdistetään K-lokukseen. Jännittävän näköiset tiikeriraidat syntyvät niin erikoisella tavalla, ettei niiden salaisuutta ole vielä saatu selville.

K niin kuin blacK

Brindlevärityksen opiskelu on aloitettava K-lokuksen ominaisuuksista. K-lokus on värigenetiikassa uusi tekijä, sillä sen löytyminen raportoitiin vasta vuonna 2007. Tämä ei koske japanilaisrotuja, mutta K-lokuksessa esiintyy dominoivaa versiota KB, joka saa aikaan täysmustan värityksen. Siksi K-lokus on nimetty sanan black viimeisen kirjaimen mukaan (B-lokus oli jo käytössä brownille.)

Miksi muuten puhutaan välillä lokuksesta ja välillä geenistä? Entä geenimuoto, versio, alleeli? K-lokus havainnollistaa uutuutensa ansiosta hyvin termien käyttöä. Kun K-lokus ensimmäistä kertaa raportoitiin, oli siitä saatu selville vasta sen summittainen sijainti kromosomin numero 16 kärjessä. Lokus tarkoittaa lokaatiota, siis vakiopaikkaa kromosomissa. Lisäksi risteytysanalyyseistä ja sukupuista oli päätelty, että K-lokuksessa esiintyi kolmea alleelia, jotka saivat aikaan täysmustan, brindlen ja "tavallisen" värisiä koiria tuossa dominanssijärjestyksessä. Vasta tämän jälkeen K-lokuksen kohtaa kromosomissa tutkittiin tarkemmin ja löydettiin sieltä geeni, joka olikin aivan muusta yhteydestä jo valmiiksi tunnettu. Geenin määritelmään kuuluu, että siitä valmistuu jotakin geenituotetta, joko proteiinia tai toiminnallista RNA-molekyyliä. Jos tätä ei ole tutkimuksilla osoitettu, ei oikeastaan voida vielä puhua geenistä. Siispä lokus.

Alleeli ja sen arkikielinen vastine "versio" on saman lokuksen vaihtoehtoisia muotoja. Osoite on sama (kromosomi 1, käsivarsi p, raita 3, alaraita 2 jne. edelleen tarkentuen) mutta siellä sijaitsevan DNA-pätkän kirjaimissa on jonkin verran eroa. Suomeksi alleeli käännetään usein geenimuodoksi... mutta kuten edellä todettua, geenimuodosta voidaan puhua vain jos kyse oikeasti on geenistä. Esimerkiksi monimuotoisuusjuttujen yhteydessä on pakko käyttää alleelia, koska niissä aniharvoin tutkitaan geenejä (pohdintatehtävä: miksi ei järjenvastaisesti tutkita monimuotoisuutta geeneistä?).

Molly. Musta brindleraidoitus ilmestyy akitalla punaisen värin päälle. Kuva: Peter Theakston https://creativecommons.org/licenses/by/2.0

Takaisin K-lokukseen ja sen kolmeen havaittuun versioon/alleeliin, jotka ovat:

  • KB (K-lokuksen dominoivin "Black"-alleeli, josta alkukirjain iso B)
  • kbr (K-lokuksen oletettu "brindle"-alleeli, joka tunnetaan vielä erittäin huonosti)
  • ky (K-lokuksen resessiivisin "yellow/muut värit"-alleeli, siksi pienet kirjaimet)

Yhteen koiraan mahtuu näitä vain kaksi kappaletta, yksi emolta peritty ja yksi isältä peritty alleeli. Ne voivat olla keskenään samanlaiset tai erilaiset. Koko rodussa eri koirilla yhteensä voi sen sijaan esiintyä vaikka kaikki mahdolliset tietyn lokuksen alleelit. Alleelien dominoivuuden ja resessiivisyyden merkityksen voi nyt päätellä, jos se ei ole jo tuttu ilmiö.

Värigeenistä valmistuu antibioottia

Luit oikein. K-lokuksessa sijaitseva geeni on nimeltään koiran betadefensiini 103 (CBD103, canine beta defensin 103). Sen ohjeella valmistetaan erästä defensiiniä, joka nimensä mukaisesti liittyy puolustautumiseen eli immuunijärjestelmän toimintaan. CBD103 on pieni peptidi eli proteiinia lyhyempi aminohappojen ketju. Laboratorio-oloissa on osoitettu, että se pystyy tuhoamaan sellaisia pöpöjä kuin E. coli ja S. aureus.

K-lokuksen geenituote. Jokainen kirjain vastaa tiettyä aminohappoa ketjussa.

Armoton kilpailu kytkimestä

Miten antibioottina toimiva molekyyli voi värjätä koko koiran mustaksi? Ja minkä ihmeen takia? Vain ensimmäiseen kysymykseen on olemassa vastaus. Dominanttimustilla koirilla K-lokuksen defensiinissä on havaittu mutaatio, jonka uskotaan muuttavan defensiinin käyttäytymistä. Mutanttidefensiini, josta on pudonnut pois yksi ainoa glysiini-aminohappo, sitoutuu nyt hanakasti pigmenttisolujen pigmenttikytkimeen ja kääntää pigmenttituotannon mustalle. Kasvavaan karvaan pakataan mustaa pigmenttiä. Normaalitilanteessa samaa pigmenttikytkintä operoi A-lokuksesta valmistuva pikkupeptidi niin että kytkin on vuoroin mustan pigmentin (eumelaniini) ja vuoroin punakeltapigmentin (feomelaniini) asennossa. K-lokuksen mutanttidefensiini syrjäyttää A-lokuksen pikkupeptidin sitoutumispaikasta samalla ajatuksella kuin häkä syrjäyttää hapen hemoglobiinista. Mutanttidefensiiniä tuotetaan K-lokuksen alleelista KB. Tavallinen defensiini, jota tuotetaan alleelista ky, antaa A-lokuksen säädellä pigmenttikytkintä, jolloin A-lokuksen värit tulevat näkyviin.

...mutta onko mustan aiheuttaja oikeasti glysiinimutaatio?

A-lokuksen tutkimus muistutti äskettäin, ettei ominaisuuden kanssa yhdessä esiintyvä mutaatio välttämättä olekaan se tekijä, joka ominaisuuden aiheuttaa. Koiran K-lokuksen kopioluvussa on havaittu vaihtelua, eli joillakin koirilla on tästä geenistä useampia kappaleita. Tämä voisi tarkoittaa sitä, että useammasta geenistä valmistuu enemmän defensiiniä naksauttamaan pigmenttikytkimiä mustalle. Nykyisten geenitestien havaitsema glysiinimutaatio on kuitenkin luotettava markkeri K-lokuksen dominanttimustalle KB-geenimuodolle.... paitsi jos koira on brindle.

Käsi ylös, jos ensikosketuksesi kainkoiraan olivat nämä veljekset.

Entä brindleväritys?

Dominanttimustan toimintaidea liittyy brindleen siten, että mustien raitojen kohdalla solut oletettavasti käyttäytyvät KB-geenimuodon mukaisesti. Raidat ilmestyvät (ainakin japanilaisroduilla) A-lokuksen perusvärin päälle siten, että feomelaniinin pigmentoimat punakeltaiset alueet raidoittuvat. Käytännössä tämä tarkoittaa punaisilla koirilla koko koiraa mukaanluettuna urajiro, joka on hyvin vaaleaa punapigmenttiä. Black-and-tan-värisillä koirilla raidat ilmestyvät urajiroon ja punaruskeisiin tan-merkkeihin. Mutta raidoittuuko akitojen urajiro oikeasti? Brindleakitojen kuvissa rinta on usein valkoinen, mutta onko siinä kyse urajirosta vai valkokirjavuudesta eli pigmentin puuttumisesta? Entä erottuuko bläkkärin selän musta brindleraidoitus milloinkaan vielä mustempana kuin selkä muuten on?

Valkoinen tiikeri

...lienee koiran geeneillä mahdottomuus. Sekä akitalla että kainkoiralla on E-lokuksen alleelivalikoimassaan resessiivinen pikku-e. Kuten shiboilla, on genotyypin e/e akita ja kainkoira väriltään valkoinen. Väri on oikeasti punapigmenttiä, mutta sävyltään niin vaaleaa, että näyttää käytännössä valkoiselta. Mustia tiikeriraitoja ei voi ilmestyä valkoisen päälle, koska pigmenttikytkin on rikki ja pysyvästi vaalean punapigmentin tuotannon asennossa. K-lokuksesta valmistuva defensiini ja A-lokuksesta valmistuva pikkupeptidi ovat kyllä valkoisellakin koiralla olemassa, mutta ne eivät pysty sitoutumaan rikkinäiseen pigmenttikytkimeen. Toisin sanoen E-lokuksen ohjeilla valmistetaan toimivia (geenimuoto E) ja rikkinäisiä (geenimuoto e) pigmenttikytkimiä. Joillakin akitoilla brindleväritys näyttää mustavalkoiselta, mutta pohjavärinä on silloinkin hailakka punainen.

Sinäkin olet salaa tiikeriraitainen

Seuraa koko brindleväritykseen perehtymisen hilpein löytö: ilmiö nimeltä Blaschkon linjat. Blaschkon linjoilla tarkoitetaan ihosolujen piilevää kuviointia, joka muodostaa selän puolelle V:n muotoisia raitoja ja muualle loivempia S-kirjaimen muotoisia kiemuroita. Kuvioinnin uskotaan kuvastavan alkionkehityksen aikana tapahtunutta ihosolujen vaellusta, kun ihosolut lähtevät jakaantuen etenemään alkion ympäri. Yksinkertaistettuna kuvioinnin "pohja" on lähtöisin yhdestä kantasolusta ja "raidat" toisesta kantasolusta. Nyt, kuvittele tilanne, jossa toisessa ihosolujen kantasolussa olisi jokin pigmenttiin vaikuttava mutaatio. Raidat tulisivat näkyviin, koska kaikissa tämän kantasolun jälkeläisissä olisi sama mutaatio. Ihmisillä Blaschkon linjat tulevat käytännössä näkyviin erilaisten sairauksien yhteydessä.

Blaschkon linjaa seuraava ihomuutos. Kuva: Littlekidsdoc/Creative Commons Attribution-Share Alike 4.0

Brindleväritykselle Blaschkon linjat tarjoavat yhden mahdollisen selityksen sille, miksi raidat ilmestyvät sinne minne ilmestyvät. Ainakin niiden on katsottu muodoltaan seuraavan Blaschkon linjoja. Asiaa ei kuitenkaan ole sen kummemmin tutkittu tai vahvistettu. Tässä hypoteesissa osa soluista lukittuisi alkiovaiheessa käyttäytymään dominantin mustan KB-alleelin mukaisesti. Miten, sitä ei tarkalleen tiedetä. Ilmiö voi liittyä epigenetiikkaan, jossa solu hiljentää aktiivisia geenejä siten, ettei niistä valmistu proteiinia. Epigeneettiset muutokset eivät näy geenitesteissä, jotka etsivät vain DNA:n kirjaimia. Varsinaista brindlen alleelia (kbr) ei myöskään ole löydetty, vaikka se näyttää periytyvän ennustettavasti. Useimmat geenitestilaboratoriot tunnistavat K-lokuksesta vain KB-alleelin tai sen puuttumisen, mikä tulkitaan ky-geenimuodoksi. Tällaisissa geenitesteissä brindlet koirat näyttävät yleensä olevan genotyyppiä KB/ky. Asiassa riittää tutkittavaa, ja geenitestien kaupallisen suosion tuntien brindlen salaisuus saattaa ratketa nopeasti.

Kainkoirien genotyyppejä

Embark-geenitestin sivustolla on avoin tietokanta testatuista koirista. Kahdentoista kainkoiran perusteella mikään värigeenitesti ei pysty vielä selittämään raidoittumisen astetta. 10/12 kainkoiraa edustaa genotyyppiä E/E ay/ay, ja näihin näyttää kuvien perusteella mahtuvan koko kirjo mustatiikeristä punatiikeriin. Yksi erittäin tumma kainkoira kantaa valkoista (E/e ay/ay) ja yksi tumman punatiikerin näköinen bläkkäriä (E/E ay/at). K-lokuksen osalta testi antaa kaikille kainkoirille tulokseksi KB/ky.

Faktaa vai fiktiota: tiikeriraitainen akita on paras karhukoira

Hopeanuolen katsoneet tietävät, että tiikeriraitaisuus eli brindlekuvio tekee akitasta ylivertaisen karhukoiran. "Tiikeriraitainen on arvokas, parempaa karhunmetsästyskoiraa ei ole olemassakaan!" Väitettä voisi pitää puhtaasti draamallisena tropena. Erikoista kyllä, vuonna 2011 julkaistu tutkimus akitojen androgeenireseptorin muuntelusta ja sen yhteydestä koiran aggressiotasoon yhdistää epäsuorasti brindleväriset akitat ja korkeamman aggressiotason. Ilmiö koskee vain uroskoiria, mikä on loogista, sillä androgeenireseptori havaitsee testosteronin. Tutkimuksessa luonnekysely tehtiin vain punaisille akitoille, ja näillä korkeimmat aggressiopisteet saivat ne koirat, joilla androgeenireseptorista esiintyi ns. lyhyttä muotoa. Brindleillä tätä lyhyttä muotoa esiintyi huomattavasti enemmän kuin pitkiä muotoja. Androgeenireseptori näyttää sijaitsevan X-kromosomissa, joten sen ei pitäisi periytyä yhdessä K-lokuksen kanssa. Eli brindlen aiheuttava alleeli ja androgeenireseptorin lyhyt muoto eivät periydy yhtenä pakettina, mikäli brindle todella sijaitsee K-lokuksessa. Koirien sukulaisuuksista ei ollut tutkimuksissa puhetta. Mene ja tiedä, ehkä Daisuke on oikeassa ja kyseessä on jokin genetiikan vielä tuntemattomien ihmeiden todellinen ilmiö. Kahden punaisen akitan ei muutenkaan pitäisi voida saada keskenään brindleä pentua.

Päivittyy edelleen...

Lähteitä ja luettavaa

Linkage and Segregation Analysis of Black and Brindle Coat Color in Domestic Dogs (Kerns ym., 2007)

A β-Defensin Mutation Causes Black Coat Color in Domestic Dogs (Candille ym., 2007)

Mapping DNA structural variation in dogs (Chen ym., 2009)

Mutations in the Melanocortin 1 Receptor, Beta-Defensin103 and Agouti Signaling Protein Genes, and Their Association with Coat Color Phenotypes in Akita-Inu Dogs (Oguro-Okano ym., 2011)

Androgen receptor gene polymorphisms are associated with aggression in Japanese Akita Inu (Konno ym., 2011)

Exploring Pleiotropic Functions of Canine β-Defensin 103: Nasal Cavity Expression, Antimicrobial Activity, and Melanocortin Receptor Activity (Aono ym., 2019)

Embark-tietokannan kainkoiria: https://embarkvet.com/resources/dog-breeds/kai-ken/

Suomenkielistä tietoa ja värivalokuvia kainkoirien erilaisista raidoituksista: https://gekkoono.weebly.com/kainkoiranvarit.html

Shibojen historiaa käsittelevissä koirakirjoissa ei voi välttyä 三河犬 :lta eli mikawankoiralta. Tarkka ilmaisu on yleensä "sekalainen mikawankoira", ja tekstin sävy on tällöin poikkeuksetta negatiivinen. Vaikuttaa siltä, että tätä koiratyyppiä on pidetty huomattavana uhkana japanilaisille alkuperäiskoirille, mutta mistä siinä oikeasti oli kyse? Tähän blogimerkintään on koottu sekalaisia mainintoja tästä mystisestä mikawankoirasta.

Koiria Mikawasta. Kuva mikawankoiria käsittelevästä osiosta kirjasta Vanha japanilainen koira - valokuva-albumi.
  • Ensinnäkin se Mikawa. Mikawan provinssi on vanha nimi nykyisen Aichin prefektuurin itäosalle. Kuten niin monilla Japanin alueilla, on sielläkin alkujaan ollut oma paikallinen koiransa, joka on ollut jonkin sortin kippurahäntäinen metsästyspystykorva ja jota on kutsuttu alkuperäiseksi mikawankoiraksi. Alkuperäinen mikawankoira on käytännössä kuollut jo sukupuuttoon.
  • Mikawan sijainti (punainen alue) on todennäköisesti iso osa ongelmaa. Naapurissa on ollut sekä Minon provinssi (jossa minoshibat) ja Shinshu (jossa shinshushibat). Sekoittumiseen on ollut lyhyt maantieteellinen matka.

  • Sitten se ongelma: kun japanilaisten alkuperäiskoirien suosio kasvoi 1900-luvun alussa, ilmestyi Mikawan alueelta risteyttämällä luotu koiratyyppi, jota markkinoitiin ja myytiin alkuperäiskoirana ympäri Japania. Syyt olivat ilmeisesti hyvin kaupallisia.

  • Risteytyksessä on käytetty ainakin kiinalaista chowchowta ja mahdollisesti shibaa tai jotakin keskikokoista japanilaisrotua.

  • Alkuperäistä mikawankoiraa ei ehkä ole ollut tässä risteymässä mukana ollenkaan. Paitsi sen epäonneksi nimessä.

  • Tämä mikawankoirasekoitus on kuvien perusteella näyttänyt suuren shiban ja pienen akitan välimuodolta. Sillä on kuvissa musta maski, usein otsakurttuja ja silmien osalta "epäitämainen ilme". Kuvista on hankala erottaa urajiroa.

  • Mielenkiintoista kyllä, "Vanha japanilainen koira - valokuva-albumi" mainitsee hybridin elinvoimaisuuden ja hedelmällisyyden leviämisen syyksi, eli ovatko nämä mikawankoirasekoitukset saaneet paljon suurempia pentueita kuin puhdasveriset alkuperäisrodut?

  • Chowchowlta mikawankoirasekoitus on oletettavasti perinyt kieleensä pigmenttitäplät.

  • Saman kirjan perusteella mikawankoirasekoituksen suosio ja leviäminen on herättänyt suuria tunteita Japanin alkuperäisrotujen suojelijoiden keskuudessa.
Tämän koiran yhteydessä mainitaan Mikawankoiran suojeluyhdistys (sekä lookin yhteneväisyys saman ajankohdan akitaan). Kuva mikawankoiria käsittelevästä osiosta kirjasta Vanha japanilainen koira - valokuva-albumi.
  • Jossakin vaiheessa on ollut olemassa Mikawankoiran suojeluyhdistys, joka sekin on keskittynyt tähän risteytysversioon.

  • "Sodan lopussa Mikawa-koiria toimitettiin yhä enemmän japanilaisina koirina koirakauppoihin valtakunnallisesti, ja yhä enemmän valtasi japanilaisia koiria, ja japanilaiset koirat lähes tuhoutuivat eri paikoissa sodan aikaisen karvan omistamisen vuoksi." (Asiat summaava Google Lens -käännös Vanhan japanilaisen koiran valokuva-albumista.)

  • Shiba Inu -kirjassa oli aiemmin puhuttu minoshiban risteytymisestä mikawankoirasekoituksen kanssa, kun kasvatuksessa on ollut tavoitteena väri. Tietty suklaanruskea väri on ollut läsnä myös mikawankoirasekoituksessa.

  • Mikawankoirasekoitus on ilmeisesti ollut jopa länsimaissa FCI:n hyväksymä koirarotu nimellä sanshu (Sanshu on toinen nimi Mikawan alueelle), kunnes rodun risteymäalkuperä on selvinnyt ja rotustatus mitätöity.

Pohdintaa mikawankoirasekoituksesta

Genetiikkafanin mielipide? Kiinnostavinta on tietenkin maininta hybridin elinvoimaisuudesta ja tähän viittaava mikawankoirasekoituksen nopea leviäminen. Japanilaisessa koirassa karsaasti katsotut ominaisuudet eli musta maski ja kielen pigmenttiläiskät, tai ainakin niiden välttely, selittyvät ehkä juuri mikawankoirasekoituksen vaikutuksella. Voi samalla kysyä, onko chowimaisen pörröturkin tavoittelu nykyshibassa historiallisesti sen järkevämpää. Mikawankoiran nimi sen sijaan näyttää kaipaavan puhdistusta, mistä johtuen otsikkoon on lisätty jälkikäteen lainausmerkit. Nythän alkuperäinen paikalliskoira on saanut niskaansa suotta negatiivisen latauksen siksi, että kaupallisen sekoituskoiran luominen sattui tapahtumaan Mikawan alueella. Nimitys sanshu on ehkä otettu käyttöön juuri sen takia.

Lähteet: "Vanha japanilainen koira -valokuva-albumi" -kirja (Google Lensin läpi) sekä Japanin ja Suomen Wikipediat (jossa lähteenä Desmond Morrisin suuri koirarotukirja).

Napin otsalla erottuu punaseesamishiballe ominainen kuvio. Kuva: Topi Kuusinen

Vuonna 2021 julkaistiin uusi tutkimus koiran värigenetiikan A-lokuksesta, jonka erilaiset geenimuodot liittyvät siihen, onko värillinen shiba punainen, seesami vai black & tan. Linkki. Tutkimuksen ehkä merkittävin uusi löytö oli geenimuoto, joka yhdistyi varjostuneen soopelin väritykseen eri roduilla. Shiboilla varjostuneen soopelin on ajateltu vastaavan sitä seesamia väritystä, jota kutsutaan myös punaseesamiksi, widow's peak -seesamiksi, Ay/at-seesamiksi tai Ays-seesamiksi. Nämä syntyjään punaiset pennut kehittävät mustan seesamikuorrutuksen päätä myöten noin puolen vuoden iässä siten, että otsalla näkyy yleensä tumma piikkikuvio. Joskus piikki voi kuitenkin näyttää enemmän palkilta. Tälle seesamityypille ei ole aiemmin ollut toimivaa geenitestiä, vaan testitulos on ollut sama kuin punaisella shiballa eli Ay.

Punaseesamishiboista on nyt tehty geenitutkimus, joka on edennyt vertaisarviointivaiheeseen ennen virallista julkaisua. Linkki. Tutkimustulokset viittaavat vahvasti siihen, että varjostuneen soopelin geenimuoto todella liittyy shiballa punaseesamiin väritykseen. Geenimuodolle on tässä tutkimuksessa annettu nimeksi Ays (Ay + shaded eli varjostunut, tosin shiban tapauksessa voi ajatella myös Ay + seesamina). Ays-seesamiväritys on resessiivinen punaiselle värille (Ay-geenimuoto), eli punainen shiba voi olla tämänkin seesamityypin kantaja ja periyttää sitä jälkeläisilleen. Jotta pennuista tulisi väritykseltään Ays-seesameja, tulee niiden tällöin periä toiselta vanhemmaltaan jokin muu kuin punainen geenimuoto Ay.

Shibojen toinen seesamityyppi, aw-seesami, perustuu aw-geenimuotoon. Tällä ns. villityypin geenimuodolla ei ole aiemmin ollut omaa mutaatiota, jolla sen olisi voinut tunnistaa, joten sen testaaminen on perustunut labratermein eliminaatioon. Uusien tutkimusten myötä myös aw on testattavissa oman promoottorinsa perusteella. Käytännössä asialla ei ole koiranomistajalle merkitystä, vaikka tutkimustulos onkin genetiikan kannalta jännittävä.

Shiban väriGeenimuotoPromoottorit
PunainenAyVP1 + HCP1
Ays-seesamiAysVP2 + HCP1
Aw-seesamiawVP2 + HCP2
BläkkäriatVP2 + HCP3
Uusista tutkimustuloksista tukea saanut taulukko liittyen shiban värigenetiikkaan ja A-lokukseen. Ylempänä oleva väri on dominoiva alempana olevien värien suhteen, eli punainen shiba voi kantaa mitä tahansa, Ays-seesami voi kantaa aw-seesamia tai bläkkäriä, aw-seesami voi kantaa bläkkäriä ja bläkkäri ei voi kantaa muuta kuin bläkkäriä. Lisäksi kaikki värit voivat kantaa valkoista. Shiballa valkoisen värin saa aikaan toinen lokus, E-lokus, jota ei käsitellä tässä.

Toistaiseksi punaseesamishiboja ja Ays-geenimuodon mahdollista kantajuutta voi geenitestata ainakin VetGenomics-laboratorion kaupallisella geenitestillä (A-lokus, laajennettu). https://vetgenomics.ru/coats

Bloginpitäjän mietteitä:

"Ehkä värigenetiikka vielä joskus pystyy selittämään myös arvoituksellisen Ays-seesamishiban ja kyseisen värityksen periytymistavan." Kirjoitin näin hiukan yli vuosi sitten ja arvelin, että ehkäpä kymmenen vuoden sisällä asiasta tulee jotain uutta tietoa. En olisi ikinä uskonut, että jo vuoden päästä on löytynyt sekä geenimuoto että analysoitu seesamit shibat. Aivan upeaa toimintaa tutkijoilta ja aktiivisilta seesamishibojen omistajilta!

Muutamia juttuja jää vielä tutkittavaksi. Yksi on valkoisen värin kantamisen vaikutus Ays-seesamin lookkiin. Näiden voisi olettaa olevan kauttaaltaan vaaleampia. Toinen on sashige eli osittainen musta sävytys punaisen päällä. Tämä geenisysteemi ei todennäköisesti pysty selittämään, miksi joillakin mustaa kantavilla punaisilla on selässä jopa näyttelytuomareita hämäävä sashigeväritys ja joillakin ei.

Äärimmillään tällainen musta kuorrutus ulottuu lähes oikeaoppisen seesamin tavoin pään yli siten, että otsalla erottuu haalea piikkikuvio. Onko tällaisella shiballa vielä omanlaisensa, tuntematon geenimuoto A-lokuksessa vai aiheuttaako ilmiön jokin muu tekijä? Kolmas asia on ikivanhat rekkarit ja tietokantamerkinnät, joissa Ays-periytymismalli ei aina näytä toimivan ihan odotetusti. A-lokus on arvaamaton, joten eiköhän sillä ole vielä uusia salaisuuksia tarjottavana.

Ja mistä tästä kaikesta on pohjimmiltaan kyse...

Pätkä A-lokuksen tuottamaa signaalimolekyyliä. Tämä pikkuinen ASIP komentaa pigmenttisoluja. Erilaiset turkin värit riippuvat siitä, missä ja milloin ASIP:ia valmistetaan. Kuva PDB:n entrystä 2L1J (Patel ym. 2010)

 

Mameshiba (oikealla) on aikuisena noin kymmenen senttiä tavallista shibaa matalampi. Kuva © 2021 Lyu, Feng, Zhu, Ren, Dang, Irwin, Wang and Zhang (Whole Genome Sequencing Reveals Signatures for Artificial Selection for Different Sizes in Japanese Primitive Dog Breeds)

Mameshibaksi kutsutaan shiban pienikokoista muunnosta (mame = papu, viittaus pienuuteen), jota tavataan lähinnä Japanissa. Mameshiboja pidetään kiistanalaisina monella tavalla: kasvatus viis veisaa shiban rotumääritelmän säkäkorkeudesta, ja pienikokoisuuteen pyrkiminen voi johtaa siihen, että jalostusvalinnoissa sivuutetaan muita tärkeitä asioita. Mameshiban suosio perustunee siihen, että pieni on söpöä. Shibojen alkuperäinen ja tärkein rotujärjestö Japanissa (NIPPO) on erikseen linjannut, ettei tunnusta mameshibaa shibaksi. Ainoa mameshiboja Japanissa rekisteröivä järjestö on The Kennel Club of Japan (KCJ), jota ei tule sekoittaa FCI:n alaiseen Japan Kennel Clubiin (JKC).

Mameshiboja koskeva konekäännös NIPPO:n nettisivulta.

Miten mameshiba eroaa geneettisesti tavallisesta shibasta?

Tämän blogipostauksen varsinainen aihe on uusi tutkimusjulkaisu, jossa on vertailtu mameshibojen ja normikokoisten shibojen genomeja. Lähtökohtana on ollut oletus, että mameshiba on sinänsä rotupuhdas shiba, jolloin eroavaisuudet geeneissä voisivat selittää nimenomaan kokoeroa. Huomioita tutkimuksesta:

  • Tutkimus on kiinalais-kanadalainen yhteistyö, ja julkaistu Frontiers in Genetics -tiedelehdessä, joka on ok-tasoinen lehti (vaikuttavuuskerroin neljän pintaan).
  • Tutkimuksessa mameshibaa kutsutaan omaksi alkuperäisrodukseen, mikä käy ilmi jo otsikosta "Whole Genome Sequencing Reveals Signatures for Artificial Selection for Different Sizes in Japanese Primitive Dog Breeds". Lukiessa tulee muutenkin vaikutelma, etteivät tutkijat ehkä ole olleet järin kiinnostuneita koirista tai roduista - kiinnostavaa on ollut shiban ja mameshiban kokoero, josta todella saa hyvän tutkimusidean kokogeenien etsintään.
  • Tutkimuksessa on otettu verinäytteet 59 normishibasta ja 35 mameshibasta. Näistä on sekvensoitu perimät (=selvitetty DNA:n emäsjärjestyksen kirjaimet) ja etsitty selkeitä eroja normishibojen ja mameshibojen välillä. Selkeä ero = jokin versio tietystä perimän kohdasta on rikastunut ja yleistynyt mameshiboissa jalostusvalinnan takia. Tuloksia on analysoitu useilla populaatiogenetiikan työkaluilla, jotka menevät tässä yli aiheen ja bloginpitäjän arviointikyvyn. Tutkimus on läpäissyt asiantuntijoiden vertaisarvioinnin hyvään lehteen, joten pitäkäämme geenituloksia luotettavina. Vakuuttavuutta lisää useiden eri analyysimenetelmien rinnakkainen käyttö.
  • Selkeitä eroja on todella löytynyt 12 perimäalueelta. Toisin sanoen tämä tutkimus on havainnut (jalostus)valintaan viittaavia alueita DNA:ssa, joissa tietynlainen versio on alkanut yleistyä mameshiboissa verrattuna normishiboihin. Kuvittele, että kasvattaisit pelkkiä bläkkärishiboja valtavalla koiramäärällä - tällöin mustien jalostuskoirien suosiminen aiheuttaisi tietenkin sen, että koirissasi alkaisi yleistyä mustan värin aikaansaava geeniversio. Sama on tapahtunut pienten mameshibojen kasvatuksessa, paitsi että kokoon vaikuttaa useampi kuin yksi geeni.
  • Tutkimustapa ei ole "geenintarkka", mutta koiran perimän tietokannasta voidaan katsoa näitä alueita tarkemmin.
  • Havaituille perimäalueille osuu yhteensä yhdeksän tunnettua geeniä, joista vain yksi (PRDM16) on aikaisemmin yhdistetty kokovaihteluun nisäkkäillä mutta ei vielä koirilla.
  • Jo aiemmin tunnetuista "koirien kokogeeneistä" tutkimus havaitsi kolme mätsäävää perimäaluetta (joilta löytyvät geenit IGF1SMAD2 ja LCORL, tuttuja MyDogDNA-profiileista), mutta ero ei ollut näiden osalta yhtä selkeä (ts. vain kaksi kolmesta analyysimenetelmästä havaitsi ne). Tulkinta: nämäkin geenit voivat selittää mameshiban pienuutta, mutta niiden vaikutus ei ole ollut ratkaiseva.
"Onpas monimutkaista!"

Lyhyt versio: tutkimuksessa löydettiin merkkejä geneettisistä jalostusvalintaeroista normishiban ja mameshiban välillä. Erot saattavat liittyä yhdeksään tunnettuun geeniin, joita voidaan pitää nyt uusina ehdokkaina koirien kokogeeneiksi. Tarkempia lisätutkimuksia näistä geeneistä on todennäköisesti tulossa lähivuosina. Populaatiogenetiikkaan perehtyneiden kannattaa tarkastella enemmän raakadataa. Tutkimuksessa ei ainakaan suoraan mainita, että mikään mameshiboissa selkeästi yleisempi perimän versio (eli oletettu kokogeenimuoto) löytyisi vain mameshiboilta mutta ei lainkaan normishiboilta. Koska mameshiban pienikokoisuus voi hyvinkin piillä useissa eri geeneissä, tavallisen kokoisille shiboille tuskin syntyy pennuksi varsinaista mameshibaa, ja poikkeava koko selittyy ennemmin kasvuhäiriöllä tai sairaudella.

Lähteitä ja luettavaa

Whole Genome Sequencing Reveals Signatures for Artificial Selection for Different Sizes in Japanese Primitive Dog Breeds (Lyu ym., 2021) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34335687/

Punasolu eli erytrosyytti on pikkuruinen verisolu, jonka tärkein tehtävä on kuljettaa happea muille elimistön soluille. Kypsyessään punasolu menettää lähes kaikki soluelimensä ja alkaa täyttyä happea sitovalla hemoglobiinilla. Verrattaen yksinkertaisesta rakenteesta huolimatta shiban ja muiden itäaasialaisten rotujen punasoluista on löydetty hämmästyttävän monia ominaisuuksia, jotka erottavat ne länsimaisten koirien punasoluista. Jokaisen shibanomistajan on hyvä olla tietoinen tärkeimmistä eroista, sillä ne saattavat joissakin tilanteissa vaikuttaa oman shiban hyvinvointiin. 

Jono punasoluja hiusverisuonessa. Hemoglobiinin sisältämä rauta saa punasolut näyttämään tummilta elektronimikroskoopissa. Ylempänä näkyvät pyöreät "jutut" on muiden solujen tumia. Näyte on peräisin hiirestä, mutta tällaisella solutasolla koira lienee samanlainen.

Nurinkuriset ionit voivat johtaa virhediagnoosiin

Aasialaisilla roduilla - shibat mukaan lukien - tavataan punasoluja, jotka sisältävät paljon kaliumia ja vähän natriumia. Useimmilla koirilla näiden elimistön toiminnan säätelyyn käytettävien ionien suhde punasoluissa on juuri päinvastainen. Eron aiheuttaa punasolun pinnalle jäävä kuljetusproteiini, joka pumppaa kaliumia sisään ja natriumia ulos.

Vuoden 1997 tutkimuksessa yli kolmasosa japanilaisista shiboista minoshibaa lukuunottamatta edusti korkean kaliumin punasoluja. Ominaisuus periytyy resessiivisesti. Runsaskaliumisia punasoluja ei pidetä sinänsä terveysriskinä, mutta ne hajoavat herkemmin osmoottisen paineen vaikutuksesta eli silloin, kun punasolujen sisälle kertyy vettä. 

Korkean kaliumin punasolut voivat vuotaa kaliumia verinäytteen seerumiosaan ja aiheuttaa verikokeen mittaustulokseen jopa vaarallisen korkealta näyttävän kaliumarvon. Shibasanomien numerossa 1/2021 tutustuttiin Julia Suuriniemen artikkelissa tarkemmin ilmiöön nimeltä Pacific Rimism eli pseudohyperkalemia. Pseudohyperkalemian mahdollisuus on shiban tapauksessa huomioitava, ettei koiraa aleta turhaan lääkitä virheellisen verikoetuloksen perusteella.

Perusterveen shiban verikokeen tuloksia. Kaliumarvo on viiterajojen sisällä, joten verinäyte ei viitannut (pseudo)hyperkalemiaan. Punasoluihin liittymätön mutta huomionarvoinen tulos shiboilla on maksavauriota ilmentävä ALAT. Rodussa esiintyy geenimuotoa, joka laskee terveen koiran ALAT-arvoa normaalia alemmas. Jos tällaisen koiran ALAT-arvo kohoaa sairauden takia, voi se näyttää testituloksissa yhä "normaalin rajoissa olevalta".

Vahvuuksia ja heikkouksia

Korkean kaliumin punasolujen aineenvaihdunnassa on havaittu tiettyjä poikkeavuuksia. Ne pystyvät esimerkiksi vastustamaan L-sorboosia, joka vaurioittaa koiran tavallisia punasoluja. L-sorboosi on sokeri, jota esiintyy pieninä määrinä mm. pihlajanmarjoissa. 

Erikoista kyllä, koirilla punatautia aiheuttava alkueläin Babesia gibsoni lisääntyy erityisen tehokkaasti korkean kaliumin punasoluissa, jolloin taudin oireet ovat oletettavasti voimakkaammat. Kyseinen loinen leviää eräiden punkkilajien välityksellä ja on toistaiseksi melko harvinainen Pohjois-Euroopassa. 

Ei sipulia etenkään shiballe

Korkean kaliumin punasoluihin kertyy yleensä moninkertainen määrä glutationi-nimistä biomolekyyliä verrattuna tavallisiin punasoluihin. Punasoluissa glutationi toimii hapettumisenestoaineena, joka suojelee hapettumiselle herkkää hemoglobiinia. Hapettuminen liittyy kemian hapetus-pelkistysreaktioihin ja on nimestä huolimatta tässä eri asia kuin kuljetettavan hapen normaali sitoutuminen hemoglobiiniin. 

Sipuli ja valkosipuli ovat koirilta kiellettyjä ruoka-aineita juuri punasolujen vuoksi. Sipulien sisältämät rikkiyhdisteet aiheuttavat punasoluissa hapettumista, jolloin punasolut vahingoittuvat ja hajoavat. Seurauksena on pahimmillaan vaikea hemolyyttinen anemia. 

Vaikka ylimääräinen glutationi näyttää suojelevan punasoluja muilta hapettavilta yhdisteiltä, on sipuli omituinen poikkeus. Shibojen runsaasti kaliumia ja glutationia sisältävät punasolut ovat vielä herkempiä vaurioitumaan sipulin rikkiyhdisteiden takia kuin tavalliset punasolut. Tämä koskee sekä raakaa että kypsennettyä sipulia.

Kohtalokkaasta määrästä sipulia per painokilo on vaikea löytää tarkkaa tietoa, mutta vanha tapauskertomus vuodelta 1977 mainitsee korkean glutationin koiran, joka sairastui vakavasti syötyään vain puolikkaan keitetyn sipulin.   

Shiban punasolu virusinfektion hillitsijänä?

Punasolun pinnalta sojottaa ulospäin monenlaisia rasva- ja hiilihydraattiketjuja. Eräs näistä glykolipideistä sisältää siaalihappo-nimisen osan, josta koirilla on kahta eri muotoa: A-tyyppi ja G-tyyppi. Länsimaisten koirien punasolut edustavat A-tyyppiä, kun taas shiboilta ja muilta itämaisilta koiraroduilta hokkaidonkoiraa lukuunottamatta löytyy myös G-tyyppiä. G-tyyppi periytyy dominoivasti. 

Asian merkitys on epäselvä, mutta solun pinnan siaalihappojen tiedetään olevan taudinaiheuttajien suosimia tarttumiskohteita. Esimerkiksi koiran parvovirus sitoutuu paljon herkemmin punasolun G-tyyppiseen siaalihappoon kuin A-tyyppiseen. Parvovirus ei kuitenkaan pysty käyttämään punasolua isäntänään, sillä se tarvitsee lisääntymiseen tumallisen solun. 

On esitetty arveluja, että punasolujen siaalihapot toimisivat kärpäspaperin tavoin  "virusloukkuina" sitoessaan taudinaiheuttajia. Tällöin G-tyypin punasolut voisivat antaa shiballe edun parvoa vastaan, mikäli viruksen leviäminen verenkierron välityksellä hidastuu. Pelkän parvon takia G-tyypin punasolut eivät silti olisi ehtineet kehittyä, sillä koiran parvovirus on mutatoitunut kissan viruksesta tiettävästi vasta 1970-luvun lopulla.

"Mikään punasolu ei korvaa rokotusta! Onko omasi muuten ajan tasalla?"

Vitaminoitu punasolu torjuu happiradikaaleja

C-vitamiini eli askorbiinihappo on tärkeä biomolekyyli sekä kasvuiässä että hapetusvaurioiden torjunnassa. Koira pystyy valmistamaan C-vitamiininsa itse, joten se ei tarvitse sitä ravinnosta. Koiranpennuilla C-vitamiinin kulutus on aikuista suurempi, joten pennun punasolut sisältävät tietyn kuljetusproteiinin, jonka kautta soluun virtaa  C-vitamiinin "käytettyä" muotoa. Punasolun sisällä käytetty vitamiininjämä muutetaan takaisin toimivaksi C-vitamiiniksi. 

Normaalisti tämä kyky häviää pennun kasvaessa. Monilla shiboilla kyseinen kuljetusproteiini kuitenkin säilyy aikuisiällä, jolloin punasolut jatkavat toimintaansa C-vitamiinin kierrätyskeskuksina. Ominaisuus periytyy resessiivisesti ja on havaittu myös akitoilla. 

C-vitamiinia punasoluissaan kierrättävät shibat ovat todennäköisesti muita paremmin suojassa hapettavilta yhdisteiltä. Yhdessä punasolujen glutationi ja C-vitamiini muodostavat jo tuplavarmistuksen hapetusvaurioiden varalta. Ovatko tällaiset erikoisuudet yleistyneet itäaasialaisissa koirissa vain sattumalta vai jotakin tarkoitusta varten rotujen vuosituhansia kestäneen historian aikana? 

Perusterveen shiban verikokeen tuloksia, jatkuu. Punasolujen eli erytrosyyttien kokonaismäärä on suuri, mutta yksittäinen punasolu on kooltaan pienehkö (MCV-arvo, yksikkö femtolitroja). Pieneen punasoluun mahtuu vähemmän hemoglobiinia (MCH-arvo, yksikkö pikogrammoja).

Punasolujen kokovaihtelut luultavasti rotuominaisuus

Vaikuttaa siltä, että shiban punasolut voivat luonnostaan olla tavallista pienikokoisempia eli mikrosytoottisia. Tällöin verikokeen tuloksissa sekä punasolujen keskitilavuus että hemoglobiiniarvo voivat olla hiukan viitearvoja alhaisempia. Myös verihiutaleiden määrä voi alittaa viitearvon alarajan. 

18 shibaa kattavassa tutkimuksessa pienikokoisia punasoluja löytyi peräti 12 shibalta. Aasialaisissa roduissa esiintyy myös anisosytoosia, jolloin saman koiran punasoluissa havaitaan epätavallista koon vaihtelua. Toisaalta korkean kaliumin punasolut voivat olla kooltaan tavallista suurempia. 

Tutkitut shibat ovat olleet kliinisesti terveitä, joten oireettomalla koiralla pienet poikkeamat viitearvoista punasolujen mittaustuloksissa saattavat olla myös tyypillinen rotukohtainen löydös ilman, että asiasta tarvitsee huolestua.    

Lähteitä ja luettavaa

Canine and feline parvoviruses preferentially recognize the non-human cell surface sialic acid N-glycolylneuraminic acid (Löfling ym., 2013)

Evaluation of frequency and intensity of asymptomatic anisocytosis in the Japanese dog breeds Shiba, Akita, and Hokkaido (Aniolek ym., 2017)

Evaluation of microcytosis in 18 Shibas (Gookin ym., 1998)

Further Studies on the Red Cell Glycolipids of Various Breeds of Dogs. A Possible Assumption about the Origin of Japanese Dogs (Hashimoto ym., 1984)

Hereditary high-potassium erythrocytes with high Na, K-ATPaSe activity in Japanese shiba dogs (Maede ym., 1990)

Heredity of red blood cells with high K and low glutathione (HK/LG) and high K and high glutathione (HK/HG) in a family of Japanese Shiba Dogs (Fujise ym., 1997)

High concentration of blood glutathione in dogs with acute hemolytic anemia (Maede, 1977)

Incidence of dogs possessing red blood cells with high K in Japan and East Asia (Fujise ym., 1997)

Inhibition of Na,K-ATPase activity reduces Babesia gibsoni infection of canine erythrocytes with inherited high K, low Na concentrations (Yamasaki ym., 2005)

Japanese Shiba dogs possessing erythrocytes with high Glut-1 activity and high ascorbic acid recycling capacity (Ogawa ja Hishiyama, 2011)

L-Sorbose does not cause hemolysis in dog erythrocytes with inherited high Na, K-atpase activity (Goto ym., 1992)

Pseudohyperkalemia eli "Pacific Rimism" (Julia Suuriniemi, Shibasanomat 1/2021)

Reduced glutathione accelerates the oxidative damage produced by sodium n-propylthiosulfate, one of the causative agents of onion-induced hemolytic anemia in dogs (Yamato ym., 1999)

Shiban värigenetiikassa ei toistaiseksi tunneta niitä geneettisiä tekijöitä, jotka saavat aikaa punaisten shibojen sävyerot kermanvärisestä ja oljenvaaleasta aina oranssiin ja tummaan punaruskeaan. Sama epätietoisuus liittyy shiban valkoiseen väriin. Shiballa sekä punainen että valkoinen väri ovat samaa punapigmenttiä eli feomelaniinia eri tummuusasteilla.

Uudessa tutkimuksessa (Slavney ym., 2021) on jäljitetty koiran genomista niitä mutaatioita, jotka voidaan yhdistää eri sävyjä edustaviin punaisiin koiriin. Mukana on ollut myös useita shiboja. Tutkimuksessa havaittiin viisi lokusta - kaksi jo tunnettua ja kolme uutta - jotka yhdessä selittivät 70 % feomelaniinin sävyeroista. Tulokset eivät shibojen osalta tarjoa selkeää selitystä sävyeroille, mutta tuovat silti mielenkiintoista tietoa rodussa esiintyvästä geneettisestä muuntelusta.

Tutkimus toteutettiin määrittämällä ensin soopelien (shiballa punainen) tai resessiivisten punaisten (shiballa valkoinen) koirien kuvista värin sävy kuusiportaisella asteikolla, jossa 1 on vaaleinta valkoista ja 6 tumminta punaista. Tuloksena on jo tässä vaiheessa kiinnostava taulukko. Useimmat shibat saivat sävyarvon 4 riippumatta siitä, olivatko ne valkoisen tai mustan kantajia tai eivät. Sen sijaan kaksi tumminta punaista shibaa on aineistossa ollut hiukan yllättäen valkoisen kantajia, jotka kantavat myös mustaa.

Tutkimuksen viisi varsinaista lokusta on toistaiseksi nimetty vain kromosomisijaintinsa mukaisesti (CFA = Canis familiariksen eli kesykoiran kromosomi). Niissä havaittu muuntelu on nimetty punaiseen väriin yhdistyväksi ja kermanväriseen yhdistyväksi. Yhteenvetona shiboista: yksi lokus eli CFA2 on ollut aineiston shiboilla vain kermanväriseen yhdistyvää muotoa, yksi lokus (CFA20) vain punaiseen yhdistyvää muotoa, yhdessä lokuksessa (CFA15) on melko tasaisesti molempia, ja loput kaksi (CFA18 ja CFA21) ovat useimmiten kermaa mutta rodussa esiintyy näistä myös punaista. Aineiston perusteella shibojen keskinäisiä sävyeroja voisi siis selittää 3/5 uudesta lokuksesta - loput kaksi näyttävät olevan samanlaiset kaikilla shiboilla.

Alla olevasta taulukosta voi halutessaan yrittää keksiä trendejä 😀 Lukemat 0, 1 ja 2 tarkoittavat punaiseen väriin yhdistyvän alleelin kopiolukua vastinkromosomeissa.

Havaittuihin lokuksiin liittyvistä geeniehdokkaista lisää myöhemmin.

"Hee hee! Uudesta hienosta tutkimuksesta selvisi vaan se, että olemme vieläkin ihan saman värisiä eri geeneillä! Mutta nyt valkoisen kantajakin voi virallisesti olla tummanpunainen."

Lähteitä ja luettavaa:

Five genetic variants explain over 70% of hair coat pheomelanin intensity variation in purebred and mixed breed domestic dogs https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0250579